TECNOLOGIE DEL DNA RICOMBINANTE

A partire dagli anni '70 si sono verificate alcune scoperte che hanno portato a metodologie di grande importanza; una di queste è la scoperta degli enzimi di restrizione che ha aperto la strada alle tecnologie del dna ricombinante. Lo sviluppo delle biotecnologie applicato al campo medico e al settore alimentare ha permesso un notevole miglioramento della vita dell'uomo.

Le tecniche del DNA ricombinante si basano sul fatto che è possibile tagliare in modo specifico molecole di DNA, anche di diversa provenienza, per mezzo di particolari enzimi detti enzimi di restrizione. Questo è reso possibile dalla capacità di tali enzimi di tagliare il DNA in modo specifico riconoscendo sequenze chiamate siti di restrizione.

 

Gli enzimi dapprima riconoscono alcune sequenze lunghe da 4 a 8 nucleotidi che sono palindrome nei due filamenti di DNA, quindi si legano ad esse e le tagliano in due siti uguali e simmetrici.

Si formano due molecole di DNA che terminano con sequenze opposte chiamate estremità adesive, in quanto in opportune condizioni possono congiungersi di nuovo tra loro. La riunione avviene attraverso la formazione di legami idrogeno che uniscono le molecole del DNA le quali vengono saldate da enzimi chiamati ligasi. E' anche possibile ottenere frammenti di restrizione provenienti da organismi diversi e ricombinarli tra loro; questa possibilità serve per il trasferimento di geni da un organismo ad un altro. Le molecole chimeriche così ottenute possono essere prodotte in quantità illimitata facendole replicare nei batteri.

La tecnica del DNA ricombinante consente il processo di clonazione molecolare e quest'operazione può essere suddivisa in tre stadi:

• isolamento del gene;
• creazione di una molecola ibrida tra il gene e un vettore in grado di trasportarla nelle cellule ospiti;
• introduzione del vettore di clonazione, unito alla sequenza da clonare, all'interno della cellula ospite.I vettori più usati sono in genere i plasmidi.

 

Il plasmide viene estratto dai batteri e isolato in numerose copie; la sua molecola viene tagliata con l'enzima di restrizione usato per tagliare il DNA esogeno. I frammenti di restrizione e i plasmidi si fanno interagire in opportune soluzioni e le loro estremità adesive formano legami idrogeno e si riuniscono. Tale unione è resa stabile dall'enzima DNA-ligasi.

I plasmidi così ricombinati (e con geni resistenti ad un antibiotico come ad esempio l'ampicillina) vengono ri introdotti nei batteri e questi, posti in opportune  piastre in cui oltre al terreno di coltura sarà inserito anche l'antibiotico a cui i plasmidi sono resistenti. In questo modo siamo sicuri di aver ottenuto una coltura batterica completamente ricombinante, in quanto eventuali batteri non ricombinanti vengono uccisi dall'antibiotico. 

I batteri OGM vengono prelevati dal terreno di coltura e immessi in una beuta a 37°C per una notte; dopodichè vengono scomposti estraendo i plasmidi portatori del gene il quale viene purificato e trasformato in un farmaco.